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撰文、责编丨迦溆
2019年诺贝尔生理或医学奖在瑞典卡洛琳斯卡医学院揭晓,授予哈佛医学院的William G.Kaelin,牛津大学的Peter J.Ratcliffe以及约翰霍普金斯大学的Gregg L.Semenza.,以表彰他们在低氧感应方面("for their discoverys of how cells sense and adapt to oxygen availability")做出的贡献。值得一提的是,这三位科学家2016年曾获得拉斯克基础医学奖。
人类和哺乳动物感知氧气的重要性自不必多说,在不同氧气浓度下,细胞会做出精细反应并进行适应性的调节,揭示细胞感知氧的分子机制为包括肿瘤、心血管病、黄斑退行性病变等多种疾病的临床治疗开辟了新路径。
2016年的拉斯克基础医学奖授予William G.Kaelin、Peter J.Ratcliffe和Gregg L.Semenza之后,Cell杂志邀请了肿瘤代谢的知名专家Craig B.Thompson教授专门撰写了题为Into Thin Air: How We Sense and Respond to Hypoxia的文章介绍他们的重要发现【1】。
这篇Cell文章提到,三位科学家是分别独立展开的系列工作。整个工作的源头还要从关键的促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)说起。人类和哺乳动物的体内需要红细胞作为氧气载体然后输送到全身,而如果氧气缺乏或贫血会导致来源于肾脏分泌的EPO刺激骨髓生成新的红细胞,从而提高氧气的运输能力(注:人源EPO是1977年被纯化出来,文章发表在JBC上【2】)。
尽管很早就知道EPO刺激红细胞生产,但是细胞如何感应氧气从而调控EPO的表达呢?三位获奖人的工作正是回答了上述重要问题。接下来,我们逐步回顾一下各个重要的发现历程。
1991年,Gregg L.Semenza作为第一作者在PNAS发表题为Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer element located 3' to the human erythropoietin gene的论文(诺奖委员会的第1篇参考文献)【3】,Semenza等人通过DNase I超敏感位点研究(当某基因处于活跃转录状态时,含有这个基因的区域对于脱氧核糖核酸酶DNase I的敏感性要比无转录活性区域高百倍以上)找到了4个或者多个不同的核因子,发现至少有两个是在肝脏和肾脏的贫血或缺氧条件下诱导的,这些结果对于随后找到关键的低氧诱导因子具有重要的意义,这种因子当时就被命名为“Hypoxia-inducible factors”【3】。
随后就是如何去寻找鉴定当时所谓的Hypoxia-inducible factors了。
Gregg Semenza. IMAGE CREDIT: JOHNS HOPKINS MEDICINE
诺奖委员会的press release中主要提了1995年的PNAS(诺奖委员会的第2篇参考文献),这篇文章主要确定了HIF-1包含两个蛋白的序列:HIF-1α和HIF-1β,分析了蛋白的结构域,并且比较果蝇中的同源蛋白Per和Sim【4】。
事实上,在1991年和1995年分别发表的PNAS文章的期间,Semenza和华人学生Guang L. Wang一起还发表了大量相关的工作,包括1993年发表在JBC上的文章(被引超过1000次)主要描述了HIF-1与DNA结合的活性相关研究【5】,而1993年PNAS论文则是证明了HIF-1在低氧诱导的情况下识别序列在不同类型的哺乳细胞中具有一致性【6】。事实上,1995年一月份发表在JBC上的论文(被引超过2100次)【7】也非常重要,这篇文章主要分离纯化和鉴定了HIF-1,明确提出HIF-1主要以异二聚体形式存在,主要由120 kDa的HIF-1α和91-94 kDa的HIF-1β组成【7】。
Semenza等继续对HIF-1进行研究发现HIF-1α还能够诱导在血管生成中起重要作用的血管内皮生长因子VEGF( vascular endothelial growth factor )【8】,这表明HIF-1α作为氧传感的核心因子对调控血管系统的生成也具有重要意义,相关工作1996年发表在MCB杂志上(被引3900多次)【8】。1998年,Semenza等发表在Gene & Dev上的而研究则是通过制备HIF-1α突变的转基因小鼠确定其体内生物学功能,研究发现HIF-1α功能缺失的情况下,血管发育和氧依赖性基因的表达收到严重损害,而且导致胚胎致死【9】(被引近2500次)。
小鼠缺失HIF-1α后的表型。图片引自【9】
接下来谈谈Peter J.Ratcliffe的主要贡献。
时间回到1993年。Ratcliffe组1993年发表在PNAS杂志上的工作【10】,利用瞬时基因转染的报告基因系统偶联到促红细胞生成素基因EPO 3'的转录增强子,结果显示了氧气感知系统在哺乳动物细胞中广泛存在,而不限于肾脏和肝脏细胞亚群,这篇文章和Semenza组1993年的PNAS工作结论有些相似之处。
随后,1994年Ratcliffe组继续在PNAS杂志上发表论文【11】,这篇文章的主要意义在于,该研究发现了在低氧诱导情况下,糖酵解过程中的重要基因磷酸甘油酸激酶PGK(phosphoglycerate kinase)和乳酸脱氢酶LDHA( lactate dehydrogenase A)也出现了类似EPO基因被诱导表达的情况。这个研究的意义在于,HIF-1不仅仅在机体水平上负责调控缺氧的适应,而且在细胞水平上参与调解糖酵解的速率。事实上,现在关注肿瘤代谢研究的同行大多了解,HIF-1和c-Myc还有p53共同构成了调控糖酵解的核心转录因子(下图)【12】。
c-Myc、 HIF1 和 p53 对糖酵解代谢途径的调控。图片引自【12】
下面再来谈谈第三位获奖人William G.Kaelin。
Craig B.Thompson教授撰写的文章中谈到,Kaelin与专门做基础研究的Semenza和Ratcliffe不同,他是一位临床医生。Kaelin有着较好的临床训练,他主要研究一种遗传综合征,即von Hippel-Lindau病(VHL病,常染色体显性遗传性癌症易感性综合征)。这种遗传疾病会导致遗传性VHL突变的家庭罹患某些癌症的风险急剧增加。
1995年,Kaelin等人在Science上发表论文【13】,报道了VHL与Elongin B、Elongin C和CUL2形成复合物,该工作暗示了VHL/Elongin/CUL2复合物有可能起到泛素连接酶的作用,该工作为后续Ratcliffe小组1999年的Nature提供了重要的参考信息。
1996年(HIF-1正式被鉴定后的第二年),Kaelin等人发表在PNAS上的研究表明,VHL蛋白可以通过氧依赖的蛋白水解作用负性调节HIF【14】,而1999年Ratcliffe小组在Nature(诺奖委员会的第3篇参考文献)上的工作进一步确定了VHL蛋白是一个蛋白复合物的成分之一,这个蛋白复合物和SCF(Skp1/Cdc53 or Cullin/F-box)这一大类泛素连接酶非常相似,正是由于VHL功能缺失导致了HIF蛋白不能被降解【15】,因此HIF蛋白的靶基因上调,导致了肿瘤的发生。
在搞清楚了VHL降解HIF-1蛋白之后,接着又有新的问题出现,在有氧气的情况下,VHL如何降解HIF-1呢?也就是说,有什么氧特意依赖的方式降解HIF-1。
2001年,Kaelin组和Ratcliffe以“背靠背”的形式在Science杂志上发表论文(诺奖委员会的第4和第5篇参考文献)【16,17】,研究发现了HIF-1α在氧气存在的情况下多肽上的脯氨酸进行了羟基化作用,而且VHL正是特异性的结合了羟基化的HIF-1α,才导致了HIF-1α被降解。
接着问问题,是什么因素控制HIF-1α发生氧依赖性的羟化反应?
2001年,Ratcliffe组在Cell,Steve McKnight组在Science,Kaelin组先后在PNAS分别独立报道了催化HIF-1α发生羟化反应的酶【18-20】。此外,2002年发表在Gene & Dev上的工作还表明发生在天冬氨酸残基上的羟化反应可以阻止HIF-1α招募转录共激活因子【21】,事实上这是给HIF-1α上的双保险,保证细胞内的HIF-1α充分被降解。
整个氧感知的机制发现历程到这里基本上差不多了。
最后,谈点个人感受,从本文所引用的参考文献中发现,PNAS杂志是最大的赢家,事实上到后期的一些发表在CNS上的工作尽管也非常重要的,但是从原创性上讲属于“马后炮”了,早期的一篇重要JBC也特别值得关注。
笔者从诺奖开奖之时起临时准备稿件,差不多用了3个半小时了,希望这个梳理对大家深入了解整个氧感知的研究历程有清晰的认识,时间匆忙,文章中的疏漏和讹误之出在所难免,敬请读者谅解。这篇文章算是对这个国庆长假的纪念!
花絮:Peter J. Ratcliffe在接到电话时正在写基金。
William G.Kaelin,Jr.正独自在家。
Gregg L. Semenza也正在家。
参考文献
1、Thompson, C. B. (2016). Into thin air: How we sense and respond to hypoxia. Cell, 167(1), 9-11.
2、Miyake, T., Kung, C. K., & Goldwasser, E. (1977). Purification of human erythropoietin. Journal of Biological Chemistry, 252(15), 5558-5564.
3、Semenza, G.L, Nejfelt, M.K., Chi, S.M. & Antonarakis, S.E. (1991). Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer element located 3’ to the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci USA, 88, 5680-5684
4、Wang, G.L., Jiang, B.-H., Rue, E.A. & Semenza, G.L. (1995). Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 5510-5514
5、Wang, G. L., & Semenza, G. L. (1993). Characterization of hypoxia-inducible factor 1 and regulation of DNA binding activity by hypoxia. Journal of Biological Chemistry, 268(29), 21513-21518.
6、Wang, G. L., & Semenza, G. L. (1993). General involvement of hypoxia-inducible factor 1 in transcriptional response to hypoxia. Proceedings of the National Academy of Sciences, 90(9), 4304-4308.
7、Wang, G. L., & Semenza, G. L. (1995). Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. Journal of Biological Chemistry, 270(3), 1230-1237.
8、Forsythe, J. A., Jiang, B. H., Iyer, N. V., Agani, F., Leung, S. W., Koos, R. D., & Semenza, G. L. (1996). Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. Molecular and cellular biology, 16(9), 4604-4613.
9、Iyer, N. V., Kotch, L. E., Agani, F., Leung, S. W., Laughner, E., Wenger, R. H., ... & Semenza, G. L. (1998). Cellular and developmental control of O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1α. Genes & development, 12(2), 149-162.
10、Maxwell, P. H., Pugh, C. W., & Ratcliffe, P. J. (1993). Inducible operation of the erythropoietin 3'enhancer in multiple cell lines: evidence for a widespread oxygen-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences, 90(6), 2423-2427.
11、Firth, J. D., Ebert, B. L., Pugh, C. W., & Ratcliffe, P. J. (1994). Oxygen-regulated control elements in the phosphoglycerate kinase 1 and lactate dehydrogenase A genes: similarities with the erythropoietin 3'enhancer. Proceedings of the National Academy of Sciences, 91(14), 6496-6500.
12、Yeung, S. J., Pan, J., & Lee, M. H. (2008). Roles of p53, MYC and HIF-1 in regulating glycolysis—the seventh hallmark of cancer. Cellular and Molecular Life Sciences, 65(24), 3981.
13、Kibel, A., Iliopoulos, O., DeCaprio, J. A., & Kaelin, W. G. (1995). Binding of the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein to Elongin B and C. Science, 269(5229), 1444-1446.
14、Iliopoulos O,Levy A P,Jiang C,et al.Negative regulation of hypoxia-inducible genes by the von Hippel-Lindau protein.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:10595-10599
15、Maxwell P H,Wiesener M S,Chang G W,et al.The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis.Nature,1991,399:271-275
16、Jaakkola, P., Mole, D. R., Tian, Y. M., Wilson, M. I., Gielbert, J., Gaskell, S. J., ... & Maxwell, P. H. (2001). Targeting of HIF-α to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science, 292(5516), 468-472.
17、Ivan, M., Kondo, K., Yang, H., Kim, W., Valiando, J., Ohh, M., ... & Kaelin Jr, W. G. (2001). HIFα targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing. Science, 292(5516), 464-468.
18、Epstein A C,Gleadle J M,Mc Neill L A,et al.C.elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation.Cell,2001,107:43-54
19、Bruick, R. K., & McKnight, S. L. (2001). A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF. Science, 294(5545), 1337-1340.
20、Maxwell P H,Wiesener M S,Chang G W,et al.Biochemical purification and pharmacological inhibition of a mammalian prolyl hydroxylase acting on hypoxia-inducible factor.Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:13459-13464
21、Lando D,Peet D J,Gorman J J,et al.FIH-1 is an asparaginyl hydroxylase enzyme that regulates the transcriptional activity of hypoxia-inducible factor.Genes Dev,2002,16:1466-1471